《食品科學》：吉林大學張婷教授等：基於靜電相互作用的卵白蛋白與巖藻多糖相行爲分析及流變學分析
卵白蛋白（OVA）是蛋清蛋白中含量最高的蛋白質（約佔54%），由385 個氨基酸組成（分子質量爲45 kDa），是影響蛋清蛋白加工特性的主要物質。蛋白質和多糖之間的相互作用強度可以調控複合體系的結構，進而影響複合體系的透明度、穩定性和凝膠特性。巖藻多糖（FUC）是一種天然的硫酸化多糖，具有無毒和高生物相容性的特點，其碳鏈結構主要由含有硫酸基團的巖藻糖殘基組成。FUC是一種高電荷的水溶性陰離子聚合物，在生物學和醫學領域有着廣泛的應用，OVA/FUC不僅可作爲安全、大容量的載體用於靶向給藥，還可作爲具有生物活性的營養物質使用，在製備蛋白質納米顆粒方面表現出充足的潛力。
吉林大學食品科學與工程學院的張婷、袁一心、尚曉敏*等人採用濁度滴定法、Zeta電位測量等分析方法，測定OVA/FUC複合體系在不同蛋白質/多糖復配比和鹽濃度下的相行爲變化，明確二者複合凝聚的臨界pH值；利用圓二色光譜（CD）、熒光光譜和流變學等手段，解析FUC對蛋白構象和物性的影響，闡釋OVA和FUC相互作用的機制。以期爲理解硫酸化多糖與蛋白質相互作用機制奠定良好理論基礎，併爲開發基於硫酸化多糖/蛋白質複合凝聚體的功能性食品提供理論依據。
1 OVA/FUC複合凝聚相行爲分析
1.1 pH值對OVA/FUC複合凝聚的影響
多糖和蛋白質之間產生複合凝聚現象是由於帶相反電荷的生物聚合物之間的靜電引力驅動。複合體系的pH值是決定生物聚合物表面電荷密度的關鍵。如圖1所示，在酸性滴定過程中，OVA/FUC複合物的濁度明顯高於OVA或FUC單一溶液，這主要歸因於靜電引力作用促進了蛋白質和多糖之間形成複合凝聚體。在酸滴定過程中單一的FUC溶液相對澄清，其濁度低且相對恆定，這歸因於FUC分子表面的硫酸基團產生了抑制多糖分子間聚集的強靜電斥力。OVA的濁度取決於pH值，在OVA的等電點（pH 4.72）附近達到最大。對於OVA/FUC複合物，有4 個關鍵的pH值臨界點（pHc、pHφ1、pHmax和pHφ2），pHc爲濁度曲線斜率初次變化時的pH值，pHφ1是濁度曲線斜率突然增大時的pH值，pHmax是濁度達到峰值時的pH值，而pHφ2值是濁度曲線下降至穩定時的pH值。當pH＞pHc時，OVA與FUC在溶液中都帶負電，由於複合物之間的靜電排斥作用，OVA和FUC之間無法形成複合物（共溶區）。當pHφ1＜pH＜pHc時，複合溶液濁度開始增加，表明溶液中OVA和FUC形成了具有一定散射光線能力的可溶性複合物。當pH值高於蛋白質等電點時，依然可以通過靜電相互作用形成可溶性複合物，這主要是蛋白質表面少量帶正電的氨基酸與聚陰離子多糖帶負電的硫酸基團相互作用的結果，也稱之爲“正電補丁”效應。隨着進一步滴定，濁度急劇上升，當pH＜pHφ1時，出現明顯的相分離，形成不溶性複合凝聚體。OVA和FUC之間的靜電相互作用在pHmax時達到最強，導致不溶性OVA/FUC複合凝聚體的積累量達到最大。而後，隨着pH值的不斷降低，由於多糖的質子化，OVA/FUC複合凝聚物開始出現解離，乳濁液逐漸變澄清。但並未觀察到OVA/FUC複合凝聚物完全解離（即未出現pHφ2）。主要原因在於含有硫酸基團的FUC酸解離常數（p
1.2 蛋白質/多糖復配比對複合凝聚相行爲的影響
蛋白質/多糖復配比是影響複合物形成的關鍵因素之一，對複合體系的臨界pH值影響顯著。本研究進一步探討了無鹽添加條件下OVA/FUC復配比對複合凝聚體形成的影響。如圖2所示，隨着OVA/FUC質量比的增加（從1∶1增加至50∶1），OVA/FUC複合體系的濁度曲線逐漸趨於正態分佈（圖2a），臨界pH值向更高pH值遷移（圖2b）。當蛋白質/多糖質量比爲1∶1時，複合溶液濁度較低，表明FUC處於過量狀態，體系內蛋白分子可完全結合到糖鏈上，此時體系靜電斥力較強，進一步抑制了蛋白質-蛋白質分子相互作用。當蛋白質/多糖質量比從5∶1增加到50∶1時，複合溶液的濁度曲線逐漸呈現先上升後下降的趨勢，表明在較高蛋白質濃度條件下促進了複合凝聚體的形成，此時FUC糖鏈可結合多個OVA分子。圖2c爲不同蛋白質/多糖復配比複合凝聚物的外觀，質量比爲50∶1與20∶1的樣品隨着pH值降低出現了明顯的宏觀相分離，而在5∶1的體系中未觀測到類似現象。相分離由熱力學不相容而產生的排除體積效應影響，而非絮凝作用。綜上所述，當OVA/FUC質量比爲20∶1時，OVA和FUC的結合達到飽和，二者在複合凝聚過程中形成最穩定的複合凝聚體。
1.3 離子強度對OVA/FUC複合凝聚的影響
鹽離子可通過靜電屏蔽作用調控生物聚合物之間的相互作用。本實驗以OVA/FUC質量比20∶1爲條件製備複合溶液，分析NaCl濃度對OVA與FUC複合凝聚過程的影響。如圖3a所示，隨着NaCl濃度的增加，複合體系的濁度曲線在pH＜pHmax後逐漸趨於平緩。特別是當鹽濃度大於50 mmol/L時，複合溶液的濁度曲線有一個較寬的平臺期。當鹽濃度大於200 mmol/L時，濁度由於強靜電屏蔽效應而顯著提升，溶液的表觀形貌進一步證明了該變化趨勢（圖3a、c）。如圖3b所示，隨着鹽濃度的增加，pHc與pHφ1均呈現先上升後下降的趨勢，而pHmax在鹽濃度提升至100 mmol/L時消失。這一現象可解釋爲在低鹽濃度（0～100 mmol/L）條件下，鹽離子可在一定程度上提高生物聚合物的溶解度，促進形成生物聚合物之間的靜電引力，誘導凝聚體形成。在高鹽濃度下，NaCl的競爭性吸附抑制了OVA和FUC之間的靜電引力，導致臨界pH值的降低。
2OVA/FUC複合凝聚物的Zeta電位分析
靜電引力是水溶液中複合凝聚體形成的主要驅動力。此外，蛋白質和多糖的表面電荷種類與大小受溶液中環境條件的影響。通過測定OVA、FUC和OVA/FUC複合物的Zeta電位解析OVA/FUC複合物在複合凝聚過程中的靜電覆合機理。如圖4a所示，在酸滴定過程中所有樣品的Zeta電位均逐漸增加。本研究中測得OVA的等電點爲4.58，與之前的研究結果接近（等電點爲4.5）。當溶液的pH值大於OVA的等電點時，OVA分子帶負電，溶液pH值小於OVA等電點時則帶正電。FUC的p
不同鹽濃度的OVA/FUC溶液（質量比爲20∶1）中Zeta電位與pH值的關係如圖4b所示。在不含NaCl的溶液中，OVA/FUC的等電點爲4.07。鹽離子的添加使複合物的等電點發生了輕微的左移，並且複合物的等電點隨着溶液中NaCl的濃度升高而降低，這是由於NaCl的靜電屏蔽作用。在較高的離子強度下（
3OVA/FUC複合體內蛋白質構象解析
3.1 內源熒光光譜分析
在蛋白質/多糖複合體系中，蛋白質的分子結構變化與二者的複合凝聚過程密切相關。本研究進一步分析OVA與FUC在共溶區間（pH 6.0）和靜電覆合凝聚區間（pH 4.5）條件下的熒光光譜。由圖5a可知，pH 6.0條件下複合物的熒光強度峰值改變，表明OVA分子的內部構象發生了變化。與單一OVA溶液相比，少量FUC加入（質量比爲10∶1、20∶1、50∶1）使OVA熒光光譜出現一定程度的猝滅。然而，當複合體系中的FUC過量時（質量比爲5∶1、1∶1），OVA的熒光強度峰值顯著提高，這表明蛋白質內部熒光基團周圍微環境的極性增加和疏水性降低。在pH 4.5時，OVA及OVA/FUC複合物的熒光強度顯著提升（圖5b），這與酸性條件下蛋白質分子展開導致熒光基團暴露有關。值得注意的是，當OVA/FUC的質量比爲5∶1和1∶1時，OVA熒光強度的最大值提升了5 倍。由相行爲和Zeta電位結果可知，pH 4.5條件下質量比爲5∶1和1∶1的OVA/FUC複合物處於可溶性複合凝聚體區，此時複合體系中過量的聚陰離子抑制了OVA的聚集，使OVA分子在酸性條件下充分展開，熒光基團大量暴露，從而導致熒光強度顯著提高。此外，在共溶區間內FUC所有比例的複合均使OVA熒光峰值發生了明顯的紅移，這是由於OVA/FUC複合物的形成可能改變了OVA內部色氨酸殘基所處的極性疏水微環境，說明疏水相互作用也參與了OVA/FUC複合物的形成。
3.2 CD分析
爲進一步分析OVA與FUC複合凝聚過程中二者之間相互作用的分子機制，測定在pH 6.0與pH 4.5條件下不同比例OVA/FUC複合物的蛋白質二級結構變化，結果如圖6所示。蛋白質中
爲了進一步量化FUC複合對OVA二級結構的影響，使用BESTSEL軟件分析了蛋白質二級結構的含量，結果如圖6c、d所示。當pH 6.0時，FUC的添加對OVA的二級結構的影響不顯著。當pH 4.5時，FUC的存在使OVA的
4OVA/FUC複合凝聚體流變學特性分析
爲更深入地瞭解OVA/FUC凝聚體的宏觀特性，利用頻率掃描進一步探究了在pH 4.5條件下NaCl濃度和OVA/FUC質量比對凝聚體黏彈性的影響。儲能模量（
結 論
本實驗探究了pH值、離子強度和生物聚合物質量比對OVA和FUC復凝聚相行爲的影響。隨着OVA/FUC復配比的增加，可以與FUC結合的OVA分子數量增加，複合物的臨界pH值（pHc和pHφ1）向高pH值方向移動。當OVA/FUC的質量比從1∶1增加到5∶1時，由於OVA和FUC之間強烈的靜電相互作用，沒有出現明顯的pHmax。形成複合物的最佳OVA/FUC質量比是20∶1，它表現出最高的濁度，且具有較高的儲能模量。OVA和FUC之間的靜電相互作用具有顯著的鹽離子依賴性。當鹽的濃度小於100 mmol/L時，複合物的臨界pH值向更高的pH值方向移動，表明低鹽離子濃度可促進複合凝聚體的形成。然而當鹽濃度大於100 mmol/L時，靜電屏蔽效應會改變OVA與FUC之間的靜電覆合狀態，臨界pH值顯著下降。同時，FUC的加入改變了OVA蛋白質的分子構象，促進了OVA的解螺旋和三級結構的展開。綜上所述，通過改變OVA和FUC溶液的複合條件可以調控二者的複合凝聚特性，本研究可爲設計基於OVA/FUC複合物的新型水凝膠和功能性納米載體奠定理論基礎。
本文 《基於靜電相互作用的卵白蛋白與巖藻多糖相行爲分析及流變學分析》來源於《食品科學》2024年45卷第9期51-59頁，作者：張婷，袁一心，嵇競弘，龔泠靈，吳昕玲，劉靜波，尚曉敏。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230607-061。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關信息。
實習編輯：王雨婷 ；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源於文章原文及攝圖網。